二、走向割據倒幕
　　以薩摩藩力量爲後盾和基礎，大久保逐漸活躍於中央政界，其立場有一個從公武合體派轉向割據倒幕派的過程。他和久光最初的目標是，反對幕府策劃的將孝明天皇的妹妹和宮下嫁給幕府將軍德川家茂作夫人，進諫天皇敕命德川慶喜爲將軍監護，讓越前藩主松平慶永就任大老，由薩摩藩兵任京都的警衛等等。1862年，島津久光和大久保率薩摩藩兵一千人進京，向朝廷施加壓力，這樣的軍事行動在德川幕府時代尚未有過。
　　他們深知尊王攘夷激進派有馬新七等人準備乘久光進京之際舉義，襲擊佐幕派公卿，便斷然派薩摩藩兵殺死有馬等人，這就是有名的“寺田屋事件”。從中可見，大久保爲了達其目的，不惜向早年的政治夥伴開刀的冷酷手段。這個事件造成了公武合體派和尊王攘夷派的完全決裂，當然也加速了公武合體運動的進程，朝廷頒佈敕命：任命慶喜爲將軍監護，松平慶永任政事總裁，並宣佈要改革幕政。公武合體獲得成功，大久保的名聲也在中央及各藩傳播開來。
　　但另一方面，尊王攘夷運動也得到很大發展，岩倉具視被視爲朝賊而趕下臺去，長州、土佐等尊攘派力量的高漲抵消了久光等公武合體派的成功。大久保繼續奔走在京都政界。
　　由於1862年薩摩藩武士砍殺了英國人的“生麥事件”，薩摩與英國人的衝突尖銳化了，英國要求賠償，並懲辦肇事者，被久光拒絕，最後釀成了1863年的“薩英戰爭”。英國艦隊進攻鹿兒島，薩摩軍民進行了頑強抵抗，大久保是戰爭指揮官，最後因兵力懸殊，薩摩的鹿兒島被炮火破壞很重。這場戰爭使大久保對近代戰爭有了親身體驗，爲其以後的軍事活動提供了經驗。薩英戰爭之後，大久保設法從幕府借來賠款交付英國，又通過談判加強了同英國的聯繫合作，加速了薩摩藩開國的步伐。
　　孝明天皇是一個頑固派，他密敕久光率兵進京鎮壓尊攘派。大久保等人乘機與鎮守京都的松平容保聯合，於1863年9月30日（文久三年八月十八日）發動軍事政變，將尊攘志士以及尊攘公卿三條實美等七人逐出京都。不久，久光、大久保再次率兵進京，控制中央政局。1864年初，作爲公武合體運動的結晶的雄藩會議籌備就緒，設置了以德川慶喜、松平慶永、松平永保、山內容堂、伊城宗達和島津久光等六人組成的“參與議會”，在天皇的主持下討論國政方針。然而，公武合體運動是違背日本歷史發展潮流的，各雄藩各有私心，政見不同，內部極不統一，而德川慶喜則竭力讓幕府獨攬領導權。不到三個月，六個“參與”都辭職了。
　　這個公武合體派的“臨時政權”的垮臺，使大久保十分震動，也對幕府的倒行逆施深感失望。他回藩後致力於藩政改革，繼續加強同英國的合作，令藩士村田經芳研製出“村田步槍”，又於1865年派五代友厚等15人去英國。這時，日本政局更加險惡，長州尊攘派發動“禁門之變”，被薩摩、會津的聯軍擊敗，幕府進而征討長州。翌年初，高杉晉作等人在下關舉兵，獲得成功，實行倒幕割據政策。長州還通過薩摩向英國購買武器，逐漸改善了兩藩之間的關係。這種時局的發展，使大久保逐漸變成倒幕派，逐漸從公武合體的頭面人物轉變成割據倒幕的領導人之一。
　　從1866年到第二年底，大久保在京都住了一年半，以全部力量投入討幕活動，他和蟄居在家的岩倉具視取得聯繫，並派人保護他，以免被討幕過激派殺害。經過阪本龍馬、中岡慎太郎等人斡旋，薩長兩藩於1866年2月締結了倒幕同盟。幕府發動第二次征討長州的戰爭，遭受薩摩抵制，薩摩與德川慶喜的友好關係從此中斷。幕府征長失敗，將軍家茂病死（慶喜繼任將軍），使幕府進一步陷入深刻危機。
　　1867年初，朝廷召集的薩、土、越前和宇多島藩四藩藩主在京都會談，很快就歸於失敗，形勢進一步朝著武裝討幕的方向發展。不久，岩倉回到京都，與大久保一起成了倒幕的旗手。大久保先後與長州的木戶孝允、廣澤真臣，藝州的辻將曹等討論出兵討幕的問題。大久保還和西鄉聯合寫信給岩倉具視：“二百餘年太平舊習污染了人心，一旦動起干戈，反使天下耳目一新，中原彌定，構成盛舉。”
　　德川慶喜面對不利局勢，以退爲攻，率先“奉還大政”，以消除討幕口實，想憑藉巨大領地和兵力，繼續淩駕于諸侯之上。但討幕派並沒有被迷惑，他們在籌備武力討幕的同時，積極準備後於1868年1月3日成功地發動了宮廷政變。緊接著在戊辰戰爭中大久保擔任參謀，以後又任總裁局顧問處理內務，協助西鄉等人指揮作戰，從而建立和鞏固了明治新政權。